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HE染色原理和流程

发布时间:2021-06-30 10:26    浏览次数 :

HE染色即苏木精-伊红染色法( hematoxylin-eosin staining ),是石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色;伊红为酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

一张做工精良的HE切片是病理医生得以做出正确诊断的关键。HE染色是目前国内外病理诊断上广泛采用的 常规染色方法。切片质量的好坏,可直接影响疾病诊断的及时与准确性。因此,能制作出一张高质量的HE染色切片,是优秀的实验者必须掌握的技术之一。

HE染色的

原理

1、细胞核染色原理

苏木精为碱性天然染料,可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA,在DNA的双螺旋结构中,两条核苷酸链上的磷酸基向外,使DNA双螺旋的外侧带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。

2、细胞浆染色原理

细胞浆内主要成分是蛋白质,为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系,当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时,胞浆对外不显电性,此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时,大于蛋白质的等电点pH值,表现酸性电离,而带负电荷的阴离子,可被带正电荷的染料染色,现时胞核也被染色,核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下,在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷(阳离子),就可被带负电荷(阴离子)的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基正电荷(阳离子)结合而使细胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织,嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。

3、分化作用

染色后,用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去,这个过程称为分化作用,所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液,因酸能破坏苏木精的醌型结构,使组织与色素分离而褪色。经苏木精染色后,必须用0.5%盐酸乙醇分化,使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去,在进行伊红染色,才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此,在HE染色中分化是极为关键的一步。

4、返蓝作用

分化之后,苏木精在酸性条件下处于红色离子状态,呈红色,在碱性条件下处于蓝色离子状态,呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色,故分化之后,立即用水除去组织切片上的酸而终止分化,再用弱碱性水(0.2%氨水)使苏木精染上的细胞核呈现蓝色,这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝,但所需时间较长。

HE染色的

步骤

1 试剂

Reagent preparation

——固定液:常用95%乙醇和冰丙酮

——苏木精染液:称取苏木精粉0.5g,铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中,然后取NaIO 31g,水5ml,再加入甘油30ml和冰醋酸2ml,混合均匀,滤纸过滤,备用。

——伊红染液:称取0.5g水溶性伊红染液,溶于100ml蒸馏水中。

——稀盐酸乙醇溶液:用75%乙醇配制1%盐酸。

——系列浓度的乙醇、二甲苯、中性树胶。

2 流程

Experimental steps

1.样品制备

对于贴壁生长细胞,胰酶消化,调整细胞浓度约1×105/ml,滴加于盖玻片上(置于6孔板中),培养相应时间后,取出细胞爬片,用PBS 洗涤3次。

2.样品固定

95%乙醇固定20min,PBS洗涤2次,每次1min。

3.染核

苏木素染液染色2-3min,自来水洗涤。

4.分色

镜下观察,若细胞核染色过深,用1%盐酸酒精溶液分色数秒,自来水洗涤。

5.染胞质

浸入伊红染液染色1min,自来水洗涤。

6.封片

吹干或自然晾干细胞 爬片后,中性树胶封片。

3 注意事项

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1.pH值

如果组织块在福尔马林中固定时间长,组织酸化而影响细胞核着色。因此,要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min,这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳,可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

2.分色时间

分色这一步是关键,应在显微镜下控制进行,一般以细胞核染色清楚(晰)而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅,应重新染色后再行分色。

3.酒精脱水应彻底

切片经酒精脱水后,入二甲苯时可出现白色不透明状态,此为脱水不彻底,应将切片退回无水酒精,更换酒精、二甲苯,以求彻底脱水与透明。切片从二甲苯取出或进入二甲苯前,切片周边均应擦干净或吸干多余水分。

4.避免切片干燥

在染色过程中不要让切片干燥,以免切片收缩、变形,影响神经元形态。

五、避免切片污染

出现切片污染,污染物遮盖该部位的细胞或组织难以观察期形态改变。应定期过滤各种染液和试剂以避免其中的沉淀物所引起的污染。

六、避免脱蜡不完全

冬季室温低时(14℃以下),二甲苯应在水浴缸中适当加温到30℃后再脱蜡,以避免因脱蜡不完全引起的染色不均匀呈雾化状态。

七、封片注意事项

最后封固时,要用中性树脂,防止日后褪色,盖片要选大于组织块的面积,如漏出一部分不久将会褪色,所用树脂浓度要适当,树脂封固时不能有气泡。

HE染色的

补救

1 切片染色不匀补救办法

1.1 组织取材固定不当。

如组织取材过大或过厚,不能将组织完全固定,组织切片染色后出现外周固定好的部分易着色,而中间未固定好的组织 ,细胞着色模糊,使染色不均。在送检的标本中,及时用4%中性甲醛对标本固定,固定液应是标本的4倍。大标本应切开固定。

1.2 切片薄厚不均或有横纹。

切片刀有缺口时,易造成断裂,破碎和不完整。切片刀倾角过大上卷,不能连在一起,过小则切片皱起。或因螺丝松动产生振动切片易造成厚薄不均或技术人员手臂摇动切片机头力量不均易造成横纹。切片时检查切片机螺母是否拧紧。

切片刀角度是否过大或过小即可。

1.3 组织脱水,透明和浸腊处理不当

(1)组织脱水用的各级乙醇未能保证相应浓度使组织脱水不彻底

(2)二甲苯内的时间过长组织易碎也无法切出好片子。

(3)浸腊温度过高,组织变脆也不利切片染色。

1.4 染色过程处理不当

(1)组织切片脱腊不彻底,如二甲苯时间过久 ,无水乙醇不纯或时间过久,室温低,组织切片上的石蜡没有全部除掉时,含腊部分不着色或着色过浅染色液试剂量少,组织切片没有全部浸到 。

(2)组织切片上在捞片时有气泡,则气泡内组织可能染色不均。

2 切片染色模糊不清

2.1 取材:

组织标本已发生自溶或取材后没及时固定或固定液浓度不够;另固定前干枯标本,染色后易出现灰染现象,很难补救。

2.2 固定

(1)固定剂对组织有一定媒染作用,它既可与蛋白结合又能与染料结合,可增强着色能力,同时能沉淀和凝固细胞内成分,使细胞内成分产生不同折光率造成光学差异。故固定不良是造成切片染色模糊不清的主要原因

(2)在日常病理制片中淋巴结处理不当造成切片染色后组织见发灰现象,其主要原因由于细胞密集,结构复杂导致固定液难以渗透到组织深部,从而造成组织中央固定不佳,而出现彻底发灰现象。可用等量无水乙醇乙醚混合液处理切片5-10分钟,乙醇洗,水洗,3%硫酸铁铵溶液补充媒染5分钟既可。

(3)送检标本部分用乙醇固定组织,常温下乙醇的白蛋白,球蛋白不再溶于水,而核蛋白则可溶于水。故乙醇固定标本切片,切片染色不良,细胞质染色较差。切片出现模糊不清现象,其补救办法液4%中性甲醛对标本再固定。

3 其他原因

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1.温度:

包埋/切片后烤片温度过高,均会使蛋白发生质变可能发生拒染,造成切片染色模糊不清。

2.染料:

质量差或溶液配制不当,如配制苏木精时加热使氧化过度,不能生成三氧化苏木红生成四氧化苏木红使染液没有染色能力或苏木精使用时间过久,导致切片着色能力或苏木精使用时间过久,导致切片着色不良,切片模糊不清。

3.分化过度 细胞核着色淡

4.脱水

透明不彻底:切片如在二甲苯中有白雾现象发生即表示乙醇脱水未尽,应立即返回重新脱水。否则,镜下组织结构模糊不清。

5.封固

(1)注意避免封片者口鼻呼出气接触组织上封剂。

因呼出气体中会含水分;

(2)在潮湿环境中动作要快,以免空气水进入封固内响质量。

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